Estudio comparativo para la cuantificación de THC, CBD y CBN..

..poniendo en práctica el método Alpha-CAT TLC y el GC-FID

Por Sébastien Béguerie e Ignacio García
7ª Conferencia Internacional sobre los Cannabinoides en la Medicina
IACM, Colonia, Alemania, 27-28 de Septiembre, 2013

Introducción

  • El consumo de Cannabis medicinal está aumentado en todo el mundo, lo que intensifica la necesidad de prevención para entender los valores terapeúticos de los cannabinoides y sus potenciales efectos secundarios. Por lo tanto, es importante comprobar cada matriz cannabinoide para su correcta dosificación (Grant y Prof. Asoc., 2012).
  • Una gran variedad de metodologías ha sido recomendada para la selección de muestras de marihuana o plantas de Cannabis: Cromatografía en capa fina (CCF), Cromatografía Laminar de Alto Rendimiento (OPLC), Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC), Cromatografía de gases (GC) con Espectrometría de Masas (MS), Electrocromatografía Capilar (CEC), método fluoro-inmunológico de resolución en el tiempo, inmunoensayo, etc. La mayoría de estas técnicas requieren de instrumentos pesados de coste elevado, así como de una gran cantidad de tiempo (Galand y Prof. Asoc., 2004).
  • Es necesario asegurar el seguimiento en la producción. La Administración de Alimentos y Fármacos de EE. UU. (FDA) exige que todas las compañías alimenticias, farmaceúticas y nutraceúticas adheridas se abstengan de realizar pruebas con materia prima procedente del Cannabis, y de facilitar información sobre niveles de cannabinoides en productos derivados, dejando a los pacientes en una total oscuridad en cuanto a lo que están ingiriendo o inhalando (Steve Kilts, 2012).
  • Se ha realizado semicuantificación por densitometría con métodos analíticos CCF (Fischedick y Prof. Asoc., 2009).
  • La CCF puede ser el mejor método si el objetivo es examinar un gran número de muestras simultáneamente en un rápido análisis visual. Al contrario que en la comparativa de dos muestras para decidir si son iguales (o differentes), cuando un análisis cuantitativo es necesario, la valoración del origen es cualitativa, ya que la muestra en observación y las muestras de referencia son, de hecho, diferentes, por lo que no tiene sentido utilizar tegnologías más potentes como la HPLC, ya que la información cuantitativa suministrada podría dar lugar a confusión (Baker y Prof. Asoc., 1980).
  • La CCF es un método de análisis de cannabinoides de bajo coste aprobado por la Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito (ONUDD) para los controles rutinarios de contenido cannabinoide de origen cannábico (Sección de Laboratorio y Asuntos Científicos de la ONUDD, 2009).

El Alpha-CAT (test de análisis de cannabinoides) permite la medición de la concentración cannabinoide por medio del cálculo del índice de densidad de píxeles por área en cada uno de los diferentes rangos porcentuales de concentración cannabinoide, con los programas de ordenador Photoshop y Excel. Se obtiene una curva de regresión que muestra una correlación lineal. De la línea regresión de CBD, CBN, THC, THCV, CBG y CBC, se diseñaron gráficos de calibración de áreas puntuales que sirviesen de reglas de medida para tener un modo manejable y visual de medir el porcentaje de acuerdo con el tamaño de la mancha mostrada en la placa CCF.

Para verificar la exactitud de la lectura del porcentaje de cannabinoides con los patrones de Alpha-CAT se realizó un estudio ciego comparativo utilizando el instrumento GC-FID, propiedad de la Fundación CANNA, y el kit Alpha-CAT, para la cuantificación de THC, CBD y CBN.

Materiales y métodos

Elementos y protocolos utilizados en el GC-FID: 50 mg de inflorescencias secas y homogeneizadas fueron extraídas con 2.000 μl de mezcla metanol:cloroformo en proporción 9:1 y 0,2 g/l de fenantreno, y las muestras fueron sometidas a la energía de ultrasonidos (sonicación) en un baño ultrasónico. Una parte alícuota de 200 μl de la extracción fue transferida a una vial de cromatografía con 1.000 μl de metanol. El contenido cannabinoide fue analizado en un GC con detector FID. La cuantificación fue realizada utilizando una curva de calibración construida utilizando el ratio de las áreas comprendidas en el estándar interno y varios estándares referentes de concentración cannabinoide. Para la calibración fue utilizado CBN en lugar de THC. (Poortman van Der Meer y Prof. Asoc., 1999). El método permite una correcta separación de los cannabinoides CBD, CBC, THC, CBG y CBN.


Gráfico 1: resultados de Alpha-CAT

Elementos y protocolos utilizados en el Alpha-CAT: 100mg de inflorescencias secas y homogeneizadas fueron extraídas con una mezcla de disolvente, que llamaremos “líquido de ensayo”, durante 2 minutos, y fueron pasadas a una placa con recubrimiento de gel de sílice (TLC F254) de 5x10 cm, con un tubo capilar de 2 μl. La decarboxilación fue alcanzada a 150ºC durante 40 segundos utilizando el calentador y la herramienta de ajuste de Alpha-CAT. La cuantificación fue realizada a través de la lectura de los correspondientes porcentajes de cannabinoides utilizando las reglas de medida de cannabinoides de Alpha-CAT ((imagen 1)).

Para este estudio comparativo fueron utilizados cuatro lotes homogeneizados de diferentes variedades de Cannabis. Tres muestras de cada lote fueron analizadas por el método del TLC y otras tres por el del GC-FID. Los procedimientos de laboratorio tuvieron lugar en las instalaciones de CF, y los resultados del TLC se sometieron a un estudio ciego realizado con imágenes de planchas escaneadas enviadas al email de la sede de los laboratorios Alpha-CAT para una lectura Alpha-CAT de la cuantificación de cannabinoides con sus correspondientes reglas de medida.


Imagen 1: Método de densitometría de Alpha-CAT utilizando la calibración porcentual de cannabinoides Alpha-CAT

Discusión de resultados

Los porcentajes medios de cada muestra fueron comparados. Las diferencias resultantes de la comparativa de los dos métodos se situaron entre un 15,40% y un 48,82% al cuantificar el THC, y un 34,25% al cuantificar el CBD. La proporción THC:CBB fue comparable proporcionalmente. Los casos en que el CBD y el CBN se situaban por debajo del 1% daban lugar a una incoherencia en términos de cuantificación, a pesar de haber sido detectados correctamente. Esta fue la primera comparativa directa entre los protocolos GC-FID y TLC Alpha-CAT.


Imagen 2: Picos máximos de identificación y cuantificación de cannabinoides de GC-FID

El método de análisis Alpha-CAT ha demostrado ser una herramienta cualitativa válida para la detección de cannabinoides, que ofrece resultados reproducibles.. Sin embargo, únicamente técnicos experimentados en el método Alpha-CAT pueden obtener resultados semicuantitativos utilizando las reglas de medición de niveles de cannabinoides de Alpha-CAT.. Análisis cromatográficos líquidos y de gases son necesarios para una precisa cuantificación de los cannabinoides y otros compuestos activos secundarios presentes en el Cannabis.


Gráfico 2: resultados GC-FIC

Referencias

  • Igor Grant, Hampton Atkinson, Ben Gouaux, y Barth Wilsey. Medical Marijuana: Clearing Away the Smoke. Open Neurol J. 2012; 6: p. 18–25.
  • Galand N, Ernouf D, Montigny F. Separation and identification of Cannabis components by different planar chromatography techniques (TLC, AMD, OPLC). J Chromatogr Sci. 2004 Mar; 42(3) : p.130-134.
  • Steve Kilts, vice president of CannLab, Denver, CO, USA. Industry Needs to Start Taking Medical Cannabis Testing, Labeling Seriously. Medical Marijuana Business Daily, www.mmjbusinessdaily.com, 2nd of October 2012.
  • Justin T Fischedick, Ronald Glas, Arno Hazekamp, Rob Verpoorte. A qualitative and quantitative HPTLC densitometry method for the analysis of cannabinoids in Cannabis sativa L. Phytochem Anal. 2009; 20(5): p.421-426.
  • P. B. Baker, T. A. Gough, B. J. Taylor. Illicitly imported Cannabis products: some physical and chemical features indicative of their origin. Bulletin UNODC. 1980, p.31-40.
  • Sección de Laboratorio y Asuntos Científicos de la ONUDD, Recommended Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products, United Nations, publications 2009, p.36-39.
  • Poortman-van der Meer, A.J. y Huizer, H. A contribution to the improvement of accuracy in the quantitation of THC. Forensic Sci int 1999. 101, 1-8