Srovnávací studie kvantifikace THC, CBD a CBN.

..pomocí metody alfa-CAT TLC a GC-FID

Sébastien Béguerie & Ignacio García
7th mezinárodní konference o kanabinoidech v medicíně
IACM, Kolín nad Rýnem, Německo, 27.-28. září 2013

Úvod

Spotřeba léčebného konopí na celém světě roste, což zdůrazňuje potřebu prevence rizik, aby bylo možné porozumět terapeutickým hodnotám kanabinoidů a jejich možným vedlejším účinkům. Tím se stává důležité testovat každou matrici kanabinoidů z hlediska jejich dávkování (Grant a kol., 2012).

Pro stanovení vzorků marihuany nebo rostlin konopí byla doporučena celá řada metodik: V této oblasti se používají následující metody: tenkovrstvá chromatografie (TLC), optimálně výkonná laminární chromatografie (OPLC), vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC), plynová chromatografie (GC) s hmotnostní spektrometrií (MS), kapilární elektrochromatografie, časově rozlišená fluoroimunologická metoda, imunoanalýza atd.... Většina těchto technik vyžaduje těžké a nákladné přístroje a mnoho času (Galand et al, 2004).
Je nutné zajistit sledovatelnost ve výrobě. Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) vyžaduje, aby všechny farmaceutické, nutraceutické a potravinářské společnosti, které se k němu hlásí, netestovaly suroviny z léčebného konopí a neposkytovaly informace o dávkování kanabinoidů u odvozených produktů, takže pacienti nejsou informováni o tom, co vdechují nebo požívají. (Steve Kilts, 2012).
Byla provedena semikvantifikace pomocí denzitometrie s metodami TLC analýzy (Fischedick et al, 2009).
TLC může být metodou volby, pokud je cílem provést velký počet vzorků rychle, vizuálně a současně. Na rozdíl od porovnání dvou vzorků za účelem posouzení, zda jsou stejné (nebo odlišné), kdy je podstatná kvantitativní analýza, je posouzení původu kvalitativní, protože zkoumaný vzorek a referenční vzorky jsou ve skutečnosti odlišné. Nemá tedy smysl používat výkonnější techniky, jako např.
HPLC, protože poskytnuté kvantitativní informace mohou obraz zmást (Baker et al, 1980).
TLC je levná metoda pro analýzu kanabinoidů, kterou schválil Úřad OSN pro drogy a kriminalitu (UNODC) pro rutinní analýzu konopí.
kontrolu obsahu kanabinoidů a původu konopí (Laboratory and Scientific Section UNODC, 2009).

Alpha-CAT (Cannabinoid Analysis Test) umožňuje kalibraci kanabinoidní skvrny pomocí poměru počtu pixelů/povrchové plochy v každém rozsahu % kanabinoidů pomocí počítačových programů Photoshop a Excel. Získá se regresní křivka, která vykazuje lineární korelaci. Z regresní přímky CBD, CBN, THC, THCV, CBG a CBC byly navrženy kalibrační grafy plochy skvrny jako pravítka, aby bylo možné pohodlně a vizuálně měřit % podle velikosti skvrny odhalené na TLC desce.

Aby se ověřilo, jak přesně lze pomocí pravítek alfa-CAT odečíst % kanabinoidů, byla provedena slepá srovnávací studie s použitím přístroje GC-FID, který je majetkem společnosti Fundación CANNA, a TLC soupravy alfa-CAT pro kvantifikaci THC, CBD a CBN.

Materiály a metody

Podmínky GC-FID: 50 mg sušených a homogenizovaných květenství bylo extrahováno 2000 μl směsi methanol:chloroform v poměru 9:1 a 0,2 g/l fenanthrenu a vzorky byly sonikovány 15 minut v ultrazvukové lázni. Alikvotní část 200 μl extrakce byla převedena do chromatografické lahvičky s 1000 μl methanolu. Obsah kanabinoidů byl analyzován v GC s FID detektorem. Kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační křivky, která byla sestrojena na základě poměru ploch mezi vnitřním standardem a různými koncentracemi referenčních standardů kanabinoidů. Pro kalibraci byl místo THC použit CBN (Poortman van Der Meer et al, 1999). Metoda umožňuje dobré oddělení kanabinoidů CBD, CBC, THC, CBG a CBN.

Graf 1: Výsledky alfa-CAT

Podmínky alfa-CAT: 100 mg sušených a homogenizovaných květenství bylo extrahováno směsí rozpouštědel, která se bude nazývat "testovací kapalina", po dobu 2 minut a bylo přeneseno pomocí 2 μl kapilární zkumavky na desku 5x10 cm předem pokrytou silikagelem (TLC F254). Dekarboxylace bylo dosaženo při teplotě 150 °C po dobu 40 sekund pomocí ohřívacího zařízení alfa-CAT a nástroje pro vyrovnávání. Destičky byly vyvolány a obarveny pomocí solného barviva Fast Blue B. Kvantifikace byla provedena odečtením odpovídajících procent kanabinoidů pomocí pravítek alfa-CAT pro kanabinoidy. (obrázek1).

Pro tuto srovnávací studii byly použity 4 homogenizované šarže různých odrůd konopí. Z každé šarže byly 3 vzorky analyzovány pomocí TLC a 3 pomocí GC/FID. Laboratorní postupy byly provedeny na místě CF a výsledky TLC byly testovány naslepo, přenášeny pomocí snímků desek do e-mailu vedoucího laboratoře alfa-CAT pro kvantifikaci kanabinoidů odečtem alfa-CAT s odpovídajícími pravítky kanabinoidů.

Obrázek 1: metoda denzitometrie alfa-CAT s použitím kalibrace kanabinoidů alfa-CAT %.

Diskuse

Byly porovnány průměrné procentuální hodnoty jednotlivých vzorků. Při porovnání obou metod byly zjištěny rozdíly mezi 15,40 % a 48,82 % při kvantifikaci THC a 34,25 % při kvantifikaci CBD. Poměr THC:CBD byl proporcionálně srovnatelný (graf 2). Při hodnotách CBD a CBN pod 1 % došlo k nesouladu z hlediska kvantifikace, přestože byly detekovány správně. Toto byla první přímá srovnávací studie mezi GC-FID a protokolem TLC alfa-CAT.

Obrázek 2: Identifikační a kvantifikační píky kanabinoidů GC-FID

Testovací metoda Alpha-CAT se ukázala jako platný kvalitativní nástroj pro detekci kanabinoidů a poskytuje reprodukovatelné výsledky. Pouze technici dobře vyškolení v metodě soupravy alpha-CAT však mohou získat semikvantitativní výsledky pomocí kanabinoidních pravítek alpha-CAT. Pro přesnou kvantifikaci kanabinoidů a dalších důležitých sekundárních aktivních látek přítomných v konopí je třeba použít plynovou nebo kapalinovou chromatografickou analýzu.

Graf 2: Výsledky GC-FIC

Odkazy